外泌体病理实验

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外泌体分离/鉴定/测序

1、技术简介

        外泌体(Exosomes)是细胞分泌到胞外的一种囊泡(Extracellular Vesicles,EVs),其大小为30-150nm,具有双层膜结构和茶托状形态,含有丰富的内含物(包括核酸、蛋白和脂质等),参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中,包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等,同时也存在于组织样本中,如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递,调控细胞生理活动。同时,外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用。

2、分离

        根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是后续开展外泌体研究的关键步骤,目前差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”,也是高分文章中首选的分离方法。

3、鉴定

        鉴定方法从物理特征到表面分子标志物,多角度进行鉴定。主要有以下几种方式:
         1. 透射电镜鉴定法:简称TEM,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。
         2. 纳米颗粒跟踪分析法:简称NTA,该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快,检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。
         3. Western blot分子标志物检测。
         4.纳米流式检测优势,可以节省外泌体使用量并提供抗体阳性率的定量结果。检测CD9\CD63\CD81等表面蛋白除了WB,也可以用纳米流式来检测,纳米流式检测的是表面蛋白表达的阳性率,这个阳性率也会因样本而不同,从百分之几到几十都有。

4、测序

        外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸,可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等进入受体细胞,参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和RNA不太相同,可作为多种疾病的早期诊断标记物,也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。 包括:miRNA高通量测序, mRNA高通量测序, lncRNA芯片(人、小鼠), ceRNA芯片(人、小鼠), 蛋白质组分析(iTRAQ、TMT、Label-free).